· polyacrylamidGelen skal blandes med acrylamidmonomer, polymerisationsudgangsmateriale, katalysator og salt- og bufferblandingen.
· akrylamidog BIS (N,N'-methylen-dobbeltacrylamid) er monomerformen på gelmatrix.
· ammoniumpersulfat-startpolymerisationsproces for klæbemiddel. Formuleringen af limen kræver en 10% ammoniumpersulfatopløsning tilberedt i vand. De fleste oplysninger indikerede et behov for aktiv brug. 10%-opløsningen kan dog placeres ved 4℃ i flere uger uden væsentligt tab af aktivitet. Fyld op til 10 ml og kasser, når limen ikke aggregerer.
Tip: Procentdelen afakrylamidI sekventering er lim og proteinlim ikke det samme. Hvis du bruger en præfabrikeret akrylamid-BIS-opløsning, skal du sørge for at få den rigtige flaske.
· TEMED (N,N,N',N'-tetramethylethylendiamin) er en katalysator i en brun flaske, der placeres i køleskabet. Tilsæt lige før limen hældes.
· Polyacrylamidelektroforeseglas, der anvendes til elektroforese, skal vaskes før og efter hver elektroforese. Efter elektroforese vaskes glaset med en blød børste og klud i varmt sæbevand, skylles med destilleret vand og lades tørre.
· Fugt og støv kan forårsage problemer med hul polymer. Før elektroforese rengøres glaspladen med glasrens og tørres af med en blød børste. Vask med destilleret vand og tør grundigt med en papirserviet. Skylning med 70% ethanol før aftørring med papir hjælper med at rengøre og fremskynde tørringen. Tilsæt prøver af acrylamid successivt: BIS, vand, bufferopløsning, ammoniumpersulfat, TEMED. Ryst godt og hæld straks.
Det er ikke nødvendigt at afgasse polyacrylamid før polymerisation. (Acrylamid blev tidligere placeret i vakuum for at fjerne bobler, fordi ilt hæmmer polymerisation.)
Prøvespidser til vandrette limpunkter.
· Læg et stykke sort papir i den nederste kasse med sort baggrund for at lave et hul til prøven, så man kan se det tydeligere.
· buffer fyldt med limtank, lige over kolloiden.
· Hvis kanten har et lys, tænd lyset, lad lyset skinne kolloidt. Træk prøven op i pipetten.
· brug af automatisk pipetteringsenhed.
· I 10-200 μ1 kan et væskebevægelsespunkt bruges i de fleste punkter på prøven. Til meget små prøvehuller (mindre end 10μ1) er det lange pipettehoved, der bruges til sekventeringslim, mere praktisk.
· pipettering, der blot er nedsænket i prøven, og inhalering af langsomt strømmende væske. Prøven kan virke klæbrig af glycerin, og hurtig pumpning kan trække luftbobler ind i pipettehovedet.
· Efter inhalation af prøvernes pipettehoved bevæges væskehovedet forsigtigt langs kanten af røret, eller der aftørres papir, suges væskehovedet ud af dråberne. Pas på ikke at suge prøven ind.
Placer prøven i prøvehullet
· Pipetteringsanordning for at opretholde et lille tryk, få prøverne til at bevæge sig en smule og overløbsvæskehovedet.
· pipettehovedet, der er indsat i bufferen, lidt højere end punkthullerne, opretholder positivt tryk. Pipettens spids kan indsættes i et lille hul.
· langsomt og støt prøverne ud. Pipettespidsen placeres over det punkterede prøvehul, og prøven vil synke ned i hullet. Lad prøven synke for at fylde prøvehullet i stedet for at skubbe den ind.
· Når den sidste dråbe prøve med væskehoved er kommet, bevæger væsken sig til det andet ben, hæv langsomt væskens bevægelse og bevæger sig ud af bufferen.
Hvordan udfører man vertikal limprøvetagning?
· lodrette limhuller i prøven dannet mellem to stykker glas. I meget tynd lim kan pipettehovedet ikke engang indsættes mellem to glasplader. Pas på glycerinen! Placer pipettehovedet over prøvehullet, og prøven vil synke ned i hullet.
· Før prøven skal du sørge for at skylle det lodrette punkt på polypropylen acylgel-prøvehullet rent. Vask upolymeriseret acrylamid og vand, der kan forekomme i bunden af prøvehullet, væk. Vandet kan gøre prøvehullet betydeligt mindre. Brug en 25 ml eller 50 ml sprøjte og en 18-gauge nål. Hæld elektroforesebufferen i, og skyl prøvehullet forsigtigt.
· Det kan være svært at se hullet i prøven, men resten er nemt. Hvis der er for mange huller, kan prøvebufferen testes med bromphenolblåt.
Opslagstidspunkt: 31. marts 2023