· polyakrylamidgel skal af akrylamidmonomer, polymerisationsudgangsmateriale, katalysator og højre for salt og bufferblanding sammen.
· akrylamidog BIS (N, N'-methylen-dobbeltacrylamid) er den monomere form af gelmatrix.
· ammoniumpersulfat start klæbende polymerisationsproces. Formuleringen af limen kræver 10% ammoniumpersulfatopløsning fremstillet i vand. De fleste af oplysningerne tydede på et behov for aktiv brug. Imidlertid kan 10% opløsningen placeres ved 4 ℃ i flere uger uden væsentligt tab af aktivitet. Fyld op til 10 ml og kassér, når limen ikke samler sig.
Tip: Procentdelen afakrylamidi sekventering er lim og proteinlim ikke det samme. Hvis du bruger færdiglavet akrylamid: BIS-opløsning, skal du sørge for at få den rigtige flaske.
· TEMED (N, N, N', N'-tetramethylethylendiamin) er en katalysator, i en brun flaske, anbragt i køleskabet. Tilsæt lige før du hælder lim.
· polyacrylamidelektroforese brugt glas i elektroforese skal vaskes før og efter hver gang. Efter elektroforese, vask med en blød børste og klud i varmt sæbevand, skyl med destilleret vand og lad det tørre.
· fugt og støv kan forårsage med hul polymer. Inden elektroforese renses glaspladen med glasrens og tørres af med en blød børste. Vask med destilleret vand og tør grundigt med en papirserviet. Skylning med 70 % ethanol inden aftørring med papir hjælper med at rense og fremskynde tørringen. Tilsæt prøver af akrylamid successivt: BIS, vand, bufferopløsning, ammoniumpersulfat, TEMED. Ryst godt og hæld straks.
Det er ikke nødvendigt at afgasse polyacrylamid før polymerisering. (Acrylamid plejede at blive anbragt i et vakuum for at fjerne bobler, fordi oxygen hæmmer polymeriseringen.)
Vandrette limpunktprøvespidser.
· læg et stykke sort papir i den nederste boks, sort baggrund for at lave et prøvehul for at se mere tydeligt.
· limbeholder fyldt buffer, lige over kolloidet.
· hvis kanten har et lys, tænd lyset, lad lyset skinne kolloid. Tegn prøven ind i pipetten.
· ved hjælp af automatisk pipettering.
· i 10-200 mu 1 flydende bevægende punkt kan bruges i de fleste af punkterne på prøven. For meget små prøvehuller (mindre end 10μ1) er det lange pipettehoved, der bruges til sekventering af lim, mere praktisk.
· pipettering lige nedsænket i prøven, inhalering af langsomt bevægende væske. Prøven kan virke klæbrig af glycerin, og hurtig pumpning kan trække luftbobler ind i pipettehovedet.
· prøver efter inhalering af pipettering hoved, vil flytte væske hovedet forsigtigt på kanten af røret eller aftørring papir suge væske hoved uden for dråberne. Pas på ikke at suge prøven.
Placer prøven i prøvehullet
· pipettering enhed for at holde et lille tryk, gør prøverne lidt flytte overløb væske hovedet.
· pipetteringshovedet indsat i bufferen, lidt højere end plethullerne, opretholder positivt tryk. Pipettens spids kan indsættes i et lille hul.
· langsomt og støt prøverne ud. Pipettespidsen placeres over punktprøvehullet, og prøven vil synke ned i hullet. Lad prøven synke for at fylde prøvehullet i stedet for at skubbe ind.
· Når den sidste prøvedråbe med væskehoved, vil væsken bevæge sig til det andet ben, langsomt hæve væsken, bevæge sig ud af bufferen
Hvordan laver man lodret limprøvetagning?
· lodrette prøvehuller med limpunkt dannet mellem to stykker glas. I meget tynd lim kan pipettehovedet ikke engang stikkes ind mellem to glasplader. Pas på glycerinen! Sæt pipettehovedet over prøvehullet, og prøven vil synke ned i hullet.
· punkt prøve før, sørg for at sætte det lodrette punkt af polypropylen acyl gel prøve hullet skylles rent. Vask det upolymeriserede akrylamid og det vand, der kan forekomme i bunden af prøvehullet, væk. Vandet kan gøre prøvehullet væsentligt mindre. Brug en 25 ml eller 50 ml sprøjte og en 18-gauge nål. Hæld elektroforesebufferen i, og skyl forsigtigt prøvehullet.
· det kan være svært at se prøvehullet, men samtidig er resten let. Hvis der er overskydende huller, kan prøvebufferen testes med bromphenolblåt.
Indlægstid: 31. marts 2023